沙门氏菌流行性的增加以及猪对抗生素耐药性增加促使人们寻找抗生素的替代品。肠杆菌肽(MccJ25)是一【yī】种由大肠杆菌【jun1】产生的抗菌肽，对包括肠道沙门氏菌在内的几种病原菌都有很强的抑制作用。
本研究旨在体外评价肠杆菌肽对猪结肠微生物区系组成和代谢活性的作用。以天然存在于人和动物的胃肠道中的罗伊氏乳杆菌与抗生素利福平进行对比试验。使用Illumina MiSeq技术对16S rRNA进行测序以评估微生物多样性，并使用液【yè】-质联用(LC-MS)和多元分析来评估抗【kàng】生素降【jiàng】解产物和监测猪结肠微生物区系代谢组的变化。
结果表明，肠杆菌肽和罗伊氏乳杆菌处理方式只引起猪结肠微生物区系微生物多样性和代谢组的细微【wēi】变化，而利福平引起氨基酸水平的显著改变。尽管这些发现需要在体内进行验证，但考虑到肠杆菌肽对【duì】病原体的选择性和强大的抑制活性，这项研究为考虑肠杆菌肽作为兽【shòu】医和农业应用中抗生素的可能替代品提供服务了第一个概念证明。
肠杆菌肽对猪肠道菌群连续培养模型的作用
Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model
由于国际市场的不断扩大，生猪生产已【yǐ】成为增长最快的产业之【zhī】一。2019年，猪肉是全球第二大消费肉类，占肉类总产量的32.6%。尽管如此，养猪业近年来遭受了重大损失，主要原因是细菌感染率不断上升。沙门氏菌会引起急性疾病，导致死亡率增加和生产力下【xià】降。猪是肠道沙门氏菌的主要宿主，沙门氏菌感染与猪只的腹泻【xiè】密切相关。许多沙门氏菌血清型已被证明与猪的慢性溃疡性结肠炎或坏死性小肠结肠炎有关。因此，在养猪场，特别是在工业化国家，控制沙门氏菌感染在很大程度上【shàng】是通过使用抗生素实现的。
抗生素被广泛应用于人类和兽医以及家畜生产中，以治疗细菌性疾病和促进动物生长。它们在养猪生产中用作生长促进剂是常见的，并对提高牲畜生产力和降【jiàng】低生产成本做出了重大贡献。然而，它们的过度使用导致了多种抗药性细菌的出现。这引起了公众的关注，并导致几个国家禁止在动物饲料中使用抗生素作为【wéi】生长促进剂。现在迫切需要有效替代常规抗生素，以维持猪群健康和生产力。到目前为止提出的最有希望的替【tì】代品是由细菌产生的天然抗菌肽。
抗菌肽是由细菌产生的，其分子质量通常小于10 kDa。与常用的广【guǎng】谱抗生素不同【tóng】，抗菌肽是从mRNA翻译而来的，其活性谱很窄，在纳摩尔浓度下抑制相同或密切相关物种的菌株。抗菌肽可广泛应用于农业食品、人类和兽医等领域。肠杆菌肽(MccJ25)是研究最多的抑制革兰氏阴性菌的抗菌肽【tài】之一。它具有典型的套索【suǒ】结构，这种高度紧凑的结构使肠杆菌肽对变性条件、高温、极端酸碱性和某些蛋白酶具有显著的稳定性。添加肠杆菌肽的日粮已被证明可以改善断奶仔猪的生长性能，减少腹泻和全身炎症。伴随着大肠杆菌减少，乳杆菌和双歧杆菌种类的增加，提高了短链脂肪酸(SCFA)的含量。
在本研究【jiū】中，我【wǒ】们使用PolyFermS连续【xù】发酵模型模拟猪近端结肠，在体外评价肠杆菌肽对猪结肠微生物区系组成和代谢活性的作用。将肠杆菌肽与广谱常规抗生素利福平、罗伊氏乳杆菌进行了相对。此外，我们通过研究这三种抗菌化合物的降解产物，探究它们对猪结肠微生物区系代谢的作用。
采用PolyFermS体外连续发酵模型，采用改良的Macfarlane培养基模拟猪近端结肠。在35天的发酵过程中，含有固定化猪粪便微生物群的第一阶段反应器与两个第二阶段控制和测试反【fǎn】应器并行运行，测试肠杆菌肽对微生物群组成和代谢活性的作用。以天然存在于人和动物的胃肠道中的罗【luó】伊氏乳杆菌与抗生素利福平进行对比试验。使用Illumina MiSeq技术对16S rRNA进行测序以评【píng】估微生物多样性，并使用液-质联用(LC-MS)和多元分析来评估细菌素/抗生素降解产物和监【jiān】测猪结肠微生物区系代谢组的变化【huà】。
图1：连续发酵实验的实验装置。
(A)由一个接种反应堆和两个试验反应堆组成的【de】PolyFermS模型概述。IR：固定化猪粪细菌的接种反应器(30%v/v)；TR1、TR2：试验生物反应器；S：稳定期【qī】；T：处理方式期；W：洗涤期。
(B)实验处理方式和样本收集时间段表。
根据PMA-qPCR分析，在加入沙门氏菌和抗菌药品后的前12小时内，试验反应器中特定菌群数量【liàng】在总体组成上维持相对稳定。然而【ér】，利福平对总细胞和拟杆菌的数量有诱导作用，直到发酵结束，除了乳酸【suān】菌科外，这些细菌群重新生长。在发酵12小时后，单独用沙门氏菌处理方式也监视到相似的效果，特别是对乳酸菌数【shù】量的作用。相比之下，罗伊氏乳杆菌和肠杆菌肽对细菌总数没有显著作用。
通过对16S rRNA基因的测序，评估了受试抗菌剂对微生物区系组成的作用。沙门氏菌处理方式和罗伊氏乳杆菌处理方式组没有检测到微生物组成的显著变化，这表明这些处理方式对24小时发酵过程中测得的总体微生物区【qū】系组成没有作用。另一方面，与沙门氏菌相比【bǐ】，肠杆菌肽和利福平有【yǒu】显著差异(p＝0.001)。
利用香农指数和asv聚类，通过α多样性研究了处理方【fāng】式对猪肠道微生物区系的作用(图2)。结果表明，在发酵结束前的8h，利福平处理方式后的α多样性显著降低，证实了利福平对微生物区系组成具有作用。在结肠发酵结束时，沙门氏菌组α多样性下降，但并不【bú】显著【zhe】；肠杆菌肽和罗伊氏乳杆菌处理方式组在发酵过程中没有引起阿尔法多样性的显著变化。
图2：用16S rRNA基因扩增序列测序法测定沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠【cháng】杆菌肽（MccJ25）、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)合用对猪肠微生物区系的作用。
通过门水平的分类分析，进【jìn】一步评估了受试抗菌剂对猪肠道微生物区系组成的作用。结果表明，利福平【píng】处理方式导致了变形杆菌和菌门变形杆菌的相对丰度增加(图3)。
图3：沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠杆菌肽（MccJ25）、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)联合接种后，猪微生物区系基于16S rRNA基因的微生物【wù】群落结构。
此外，从8小时开始，利福平对大肠杆菌(ASV002)的相对丰度显著增加(12小时的相对丰度超过44%)(图4)。
图4：沙门氏菌单独接种(Salmo)及其与肠【cháng】杆菌肽（MccJ25）、罗伊氏乳杆菌(Reut)或利福平(Rifa)联合接种对猪肠微生物区系的作用。
这些数据表明，与其他测试的抗菌剂相比，利福平显著作用微生物区系组成，会作用肠道微生物区系的代谢活动。
用LC-MS分析发酵液颗粒提取物，以评价肠杆菌肽、罗伊氏乳杆菌和利福平对猪结肠微生物区系代谢的作用。如图5所示，肠杆菌肽和利福平对代谢组学的作用【yòng】最大，但肠杆菌肽的作用随着时间段的推移而降低，而利福平的作用则增加(图5B)。处理方式24 h后，肠杆菌肽处理方式组的代谢组学特征与试验前接近。相比之下，利福平对猪结肠【cháng】微生物区系代谢组有显著作用，且【qiě】随时间段延长而增加。
图5：PolyFermS模型中猪结肠微生物区系的代谢组谱。
(A)通过LC-MS获得的每个处理方式的基峰色谱图。
(B)从LC-MS数据获得的PCA计分图(左：PC1与PC2，右：PC1与PC3)。
由于肠杆菌肽对病原菌的选择性、强大【dà】的抑制活性、稳定性以及它引起的微生物区【qū】系组成的细微变化，肠杆菌肽可能被认为是养猪领域中可能的抗生素替代品。
参考文献：Naimi S, Zirah S, Greppi A, Lacroix C, Rebuffat S, Fliss I. Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model. Front Microbiol.
